微生食物中維生素B12的測(cè)定方法
微生物測(cè)定法
1.原理
維生素B12對(duì)于Lactobacillusleichmannii（ATCC7830）的正常生長是必需的，在一定生長條件下，Lactobacillusleichmannii的生長與繁殖速度和溶液中維生素B12的含量成一定的線性關(guān)系，利用濁度法或光密度法測(cè)定細(xì)菌生長和繁殖的強(qiáng)度可間接地測(cè)定食物樣品中維生素B12的含量。本方法最低檢出限0.001ng。
2.適用范圍
本方法參考"Official Methods of Analysis of theAssociationof official AnalyticalChemists"、"MethodsofVitamin Analysis"以及"Methodsofthe Microbiological Analysis ofSelectedNutrients"。本方法適用于測(cè)定食物及飼料中的維生素B12含量。
3.試劑
本試驗(yàn)所用水均為蒸餾水，所用試劑均需分析純?cè)噭?br /> 3.1 甲苯
3.2 檸檬酸（C6H8O7·3H2O）
3.3 磷酸氫二鈉（Na2HPO4）
3.4 焦亞硫酸鈉（Na2S2O5）
3.5 抗壞血酸（生化試劑）
3.6 無水葡萄糖
3.7 無水乙酸鈉
3.8 L-胱氨酸（生化試劑）
3.9 D,L-色氨酸（生化試劑）
3.10 10mol/L氫氧化鈉溶液：稱取200g氫氧化鈉溶于適量水中，定容至500ml。
3.11 （1+4） 乙醇溶液：200ml無水乙醇與800ml水充分混勻。
3.12 酸解酪蛋白：稱取50g不含維生素的酪蛋白于500ml燒杯中，加200 ml3mol/L鹽酸，121℃高壓水解6小時(shí)。將水解物轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿內(nèi)，在沸水浴上蒸發(fā)至膏狀。加200ml水使之溶解后再蒸發(fā)至膏狀，如此反復(fù)3次，以去除鹽酸。以溴酚藍(lán)作外指示劑，用10mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至3.5。加20g活性炭，振搖，過濾，如果濾液不呈淡黃色或無色，可用活性炭重復(fù)處理。濾液加水稀釋至500ml，加少許甲苯于冰箱中保存。（該試劑也可從Difco公司購得，產(chǎn)品號(hào)為No.0288-15-6。）
? 酸解的目的是為了消除酪蛋白中的維生素，確保基本培養(yǎng)基中不含待測(cè)定的維生素B12，但有時(shí)酸水解不一定徹底，所以一定要選用不含維生素的酪蛋白粉（Sigma公司），這樣可較好地確保酸解酪蛋白中不含維生素B12。
3.13 腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶溶液：稱取硫酸腺嘌呤（純度為98%）、鹽酸鳥嘌呤（生化試劑）以及尿嘧啶各0.1g于250ml燒杯中，加75ml水和2ml濃鹽酸，然后加熱使其完全溶解，冷卻，若有沉淀產(chǎn)生，加鹽酸數(shù)滴，再加熱，如此反復(fù)，直至冷卻后無沉淀產(chǎn)生為止，以水稀釋至100ml。加少許甲苯于冰箱中保存。
3.14 維生素溶液Ⅰ：稱取25mg核黃素，25mg鹽酸硫胺素，0.25mg生物素，50mg尼克酸，用0.02mol/L乙酸溶液溶解并定容至1000ml。
3.15 維生素溶液Ⅱ：將50mg對(duì)氨基苯甲酸，25mg泛酸鈣，100mg鹽酸吡哆醇，100mg鹽酸吡哆醛，20mg鹽酸吡哆胺，5mg葉酸溶于（1+4）乙醇溶液，并定容至1000ml。
3.16 甲鹽溶液：稱取25gKH2PO4、25gK2HPO4溶于500ml水中，加5滴濃鹽酸。
3.17 乙鹽溶液： 稱取10gMgSO47H2O、0.5gNaCl、0.5gMnSO44H2O，0.5gFeSO47H2O溶于水并定容至500ml，加5滴濃鹽酸。
3.18 黃嘌呤溶液：稱取1.0g黃嘌呤溶于200ml水中，70℃加熱條件下，加入30mlNH4OH（2+3）L-天冬酰胺溶于水中，并定容至100ml。
3.19 吐溫80溶液：將25g吐溫-80溶于乙醇并定容至250ml。
3.20 維生素B12標(biāo)準(zhǔn)溶液（均使用棕色試劑瓶）
（1）3.20.1維生素B12標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（100ng/ ml）：稱取50μg（精度0.01mg天平）維生素B12暗紅色針狀結(jié)晶，用（1+4）的乙醇溶液定容至500ml，儲(chǔ)存在2～4℃條件下。
（2）3.20.2維生素B12標(biāo)準(zhǔn)中間液（1ng/ml）：取1ml儲(chǔ)備液用（1+4）的乙醇定容 至100ml.貯存于2～4℃條件下。
（3）3.20.3 維生素B12標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.02ng/ ml）：取1ml中間液用水定容至50ml，用時(shí)現(xiàn)配。
? 維生素B12見光易分解，因此在配制標(biāo)準(zhǔn)液時(shí)要盡量避光，并且一定要使用棕色試劑瓶。
3.21 基本培養(yǎng)基：將下列試劑混合于500ml燒杯中，加水至200ml，以溴甲酚紫作外指 示劑，用10mol/L氫氧化鈉液調(diào)節(jié)pH為6.0～6.1，用水稀釋至250ml。
酸解酪蛋白25ml
腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶溶液5ml
天冬胺酰溶液5ml
吐溫-80溶液5ml
甲鹽溶液5ml
乙鹽溶液5ml
維生素溶液Ⅰ5ml
維生素溶液Ⅱ5ml
黃嘌呤溶液5ml
抗壞血酸1.0g
L-胱氨酸0.1g
D,L-色氨酸0.1g
無水葡萄糖10.0g
無水乙酸鈉8.3g
該培養(yǎng)基也可從Difco公司購得，產(chǎn)品號(hào)為No.0457-15-1。
? 由于國內(nèi)某些試劑純度不夠，所以自行配制的培養(yǎng)基較渾濁，嚴(yán)重影響到最后的濁度測(cè)定結(jié)果，因此建議最好使用進(jìn)口培養(yǎng)基。
3.22 瓊脂培養(yǎng)基：在600ml水中，加入15g蛋白胨，5g水溶性酵母提取物干粉，10g無水葡萄糖，2g無水磷酸二氫鉀，100ml番茄汁，10ml吐溫-80溶液，每500ml液體培養(yǎng)基加5.0~7.5g瓊脂，加熱溶解，用10mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為6.5~6.8，然后定容至1000ml，分裝于試管中，于121℃高壓滅菌10分鐘，取出后豎直試管，待冷卻至室溫后于冰箱保存。
3.23 生理鹽水：稱取9.0g氯化鈉溶于1000ml水中，。每次使用時(shí)分別倒入2～4支試管中，每支約加10ml，塞好棉塞，于121℃高壓滅菌10分鐘，備用。
3.24 0.4g/L溴甲酚紫指示劑：稱取0.1g溴甲酚紫于小研缽內(nèi)，加1.6ml 0.1mol/L氫氧化鈉研磨，加少許水繼續(xù)研磨，直至完全溶解，用水稀釋至250ml。
4.儀器與設(shè)備
4.1 實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備
4.2 電熱恒溫培養(yǎng)箱
4.3 壓力蒸汽消毒器
4.4 液體快速混合器
4.5 離心機(jī)
4.6 硬質(zhì)玻璃試管：20mm×150mm
5.菌種與培養(yǎng)液的制備與保存
5.1 儲(chǔ)備菌種的制備：Lactobacillusleichmannii（ATCC7830）接種于直面瓊脂培養(yǎng)管中，在37±0.5℃恒溫箱中培養(yǎng)16~24小時(shí)，取出后放入冰箱中保存。每周至少傳種二次以上。在實(shí)驗(yàn)前一天必須傳種一次。
?Lactobacillusleichmannii （ATCC7830）的生命力不強(qiáng)，每周一定要至少傳代2-3次，否則極易死亡!
5.2 種子培養(yǎng)液的制備：加2ml 0.02ng/ml維生素B12標(biāo)準(zhǔn)工作液和3ml基本培養(yǎng)基于10ml離心管中，塞好棉塞，于121℃高壓滅菌10分鐘，取出冷卻后于冰箱中保存。每次制備兩管，備用。
? 加入離心管中的維生素B12標(biāo)準(zhǔn)工作液要適量，過少會(huì)阻礙Lactobacillus Leichmanni的生長，過多會(huì)使零管中的光密度值增大，影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。一般2-3ml即可。
6. 操作步驟
6.1 接種液的配制：使用前一天，將已在瓊脂管中生長16~24小時(shí)的L.leichmannii 接種于種子培養(yǎng)液中，在37±0.5℃培養(yǎng)16~24小時(shí)，取出后離心10分鐘（3000rpm），棄去上清液，用已滅菌的生理鹽水淋洗2次，再加入3ml滅菌生理鹽水，混勻后，將此液倒入已滅菌的注射器中，立即使用。
6.2 水解液的制備：稱取1.3g無水磷酸二氫鈉、1.2g檸檬酸及0.1g焦亞硫酸鈉（Na2S2O5），溶于水中并定容至100ml，用時(shí)現(xiàn)配。
6.3 稱取適量樣品，至于100ml三角瓶中，加70ml水解液，混勻，于121℃高壓滅菌10分鐘，取出冷卻至室溫，過濾，然后以溴甲酚紫為外指示劑，用10mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為6.0~6.1，將水解液移至100ml容量瓶中，定容至刻度。為保證最后樣品測(cè)定管中的Na2S2O5的濃度≤0.03mg/ml，因此要做適當(dāng)?shù)南♂尅?br /> ? 測(cè)定管中Na2S2O5的濃度一定要小于0.03mg/ml，過多會(huì)抑制L.Leichmannii的生長，因此在稱取樣品時(shí)要考慮到后來的稀釋倍數(shù)，避免由于稀釋倍數(shù)過大造成測(cè)定管中的維生素B12含量過低，無法檢出。
? 實(shí)驗(yàn)所用的所有試管必須在烤箱中180-200℃條件下干熱滅菌2-3小時(shí)。
6.4 樣品試管的制備：每組平行樣品管中分別加入1.0、2.0、3.0、4.0ml樣品水解液，并用水稀釋至5ml，然后再加入5ml基本液體培養(yǎng)基。
6.5 標(biāo)準(zhǔn)系列管的制備：每組試管中分別加入維生素B12標(biāo)準(zhǔn)工作液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，使每組試管中維生素B12的含量為0.00ng、0.02ng、0.04ng、0.06ng、0.08ng、0.1ng，加水至5ml，再加入5ml基本液體培養(yǎng)基，需做三組標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6.6 滅菌：樣品管與標(biāo)準(zhǔn)管均用棉塞塞好，于121℃高壓滅菌10分鐘。
? 滅菌時(shí)間不宜過長，否則會(huì)破壞基本培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，影響Lactobacillus Leichmannii的生長，最好在5-10分鐘內(nèi)。
6.7 接種與培養(yǎng)：待試管冷至室溫后，每管接一滴種子菌液，于37±0.5℃恒溫箱中培養(yǎng)16~20小時(shí)。
? （1）接種前，接種室要在紫外燈下消毒至少30分鐘。（2）在接種時(shí)，其中一支標(biāo)準(zhǔn)系列0管可不接種，這樣可觀察此次實(shí)驗(yàn)是否存在污染，并且可消除由于管中液體的顏色造成的誤差。
6.8 測(cè)定光密度值：于640nm波長條件下，以標(biāo)準(zhǔn)系列中零管調(diào)節(jié)儀器零點(diǎn)，測(cè)定樣品管液體及標(biāo)準(zhǔn)管液體的光密度值。
? 首先以未接種的標(biāo)準(zhǔn)系列0管進(jìn)行儀器調(diào)零，然后在用接種后的標(biāo)準(zhǔn)系列0管進(jìn)行二次調(diào)零，之后再測(cè)定其他管中液體的光密度值。
7.結(jié)果計(jì)算
以維生素B12標(biāo)準(zhǔn)系列的不同納克數(shù)為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由樣品測(cè)定管中的光密度值在曲線上查出相對(duì)應(yīng)的樣品測(cè)定管中的維生素B12含量，再按以下公式計(jì)算樣品中維生素B12含量：
     c·V·f
X= --------------×100
      m×1000
式中：
X──樣品中維生素B12含量，μg/100g：
c──測(cè)定管中的維生素B12含量，ng：
V──樣品水解液的定容體積，ml：
f──樣品液的稀釋倍數(shù)
m──樣品質(zhì)量，g。
100/1000 ── 單位換算系數(shù)
8.注意事項(xiàng)
（1） 全部實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)注意避免日光直接照射。
（2） 在人體腸道中，大腸桿菌可以合成維生素B12，因此，此實(shí)驗(yàn)極易被污染，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，最重要的是注意清潔問題，確保所用的玻璃器皿、操作環(huán)境要清潔。