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  • 微生食物中維生素B12的測(cè)定方法

    發(fā)布于 2011/12/12閱讀(1988)來源 zxj標(biāo)簽 維生素

    摘要

    微生食物中維生素B12的測(cè)定方法

    內(nèi)容

    微生食物中維生素B12的測(cè)定方法
    微生物測(cè)定法
    1.原理
    維生素B12對(duì)于Lactobacillusleichmannii(ATCC7830)的正常生長是必需的,在一定生長條件下,Lactobacillusleichmannii的生長與繁殖速度和溶液中維生素B12的含量成一定的線性關(guān)系,利用濁度法或光密度法測(cè)定細(xì)菌生長和繁殖的強(qiáng)度可間接地測(cè)定食物樣品中維生素B12的含量。本方法最低檢出限0.001ng。
    2.適用范圍
    本方法參考"Official Methods of Analysis of theAssociationof official AnalyticalChemists"、"MethodsofVitamin Analysis"以及"Methodsofthe Microbiological Analysis ofSelectedNutrients"。本方法適用于測(cè)定食物及飼料中的維生素B12含量。
    3.試劑
    本試驗(yàn)所用水均為蒸餾水,所用試劑均需分析純?cè)噭?br /> 3.1 甲苯
    3.2 檸檬酸(C6H8O7·3H2O)
    3.3 磷酸氫二鈉(Na2HPO4)
    3.4 焦亞硫酸鈉(Na2S2O5)
    3.5 抗壞血酸(生化試劑)
    3.6 無水葡萄糖
    3.7 無水乙酸鈉
    3.8 L-胱氨酸(生化試劑)
    3.9 D,L-色氨酸(生化試劑)
    3.10 10mol/L氫氧化鈉溶液:稱取200g氫氧化鈉溶于適量水中,定容至500ml。
    3.11 (1+4) 乙醇溶液:200ml無水乙醇與800ml水充分混勻。
    3.12 酸解酪蛋白:稱取50g不含維生素的酪蛋白于500ml燒杯中,加200 ml3mol/L鹽酸,121℃高壓水解6小時(shí)。將水解物轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿內(nèi),在沸水浴上蒸發(fā)至膏狀。加200ml水使之溶解后再蒸發(fā)至膏狀,如此反復(fù)3次,以去除鹽酸。以溴酚藍(lán)作外指示劑,用10mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至3.5。加20g活性炭,振搖,過濾,如果濾液不呈淡黃色或無色,可用活性炭重復(fù)處理。濾液加水稀釋至500ml,加少許甲苯于冰箱中保存。(該試劑也可從Difco公司購得,產(chǎn)品號(hào)為No.0288-15-6。)
    ? 酸解的目的是為了消除酪蛋白中的維生素,確保基本培養(yǎng)基中不含待測(cè)定的維生素B12,但有時(shí)酸水解不一定徹底,所以一定要選用不含維生素的酪蛋白粉(Sigma公司),這樣可較好地確保酸解酪蛋白中不含維生素B12。
    3.13 腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶溶液:稱取硫酸腺嘌呤(純度為98%)、鹽酸鳥嘌呤(生化試劑)以及尿嘧啶各0.1g于250ml燒杯中,加75ml水和2ml濃鹽酸,然后加熱使其完全溶解,冷卻,若有沉淀產(chǎn)生,加鹽酸數(shù)滴,再加熱,如此反復(fù),直至冷卻后無沉淀產(chǎn)生為止,以水稀釋至100ml。加少許甲苯于冰箱中保存。
    3.14 維生素溶液Ⅰ:稱取25mg核黃素,25mg鹽酸硫胺素,0.25mg生物素,50mg尼克酸,用0.02mol/L乙酸溶液溶解并定容至1000ml。
    3.15 維生素溶液Ⅱ:將50mg對(duì)氨基苯甲酸,25mg泛酸鈣,100mg鹽酸吡哆醇,100mg鹽酸吡哆醛,20mg鹽酸吡哆胺,5mg葉酸溶于(1+4)乙醇溶液,并定容至1000ml。
    3.16 甲鹽溶液:稱取25gKH2PO4、25gK2HPO4溶于500ml水中,加5滴濃鹽酸。
    3.17 乙鹽溶液: 稱取10gMgSO47H2O、0.5gNaCl、0.5gMnSO44H2O,0.5gFeSO47H2O溶于水并定容至500ml,加5滴濃鹽酸。
    3.18 黃嘌呤溶液:稱取1.0g黃嘌呤溶于200ml水中,70℃加熱條件下,加入30mlNH4OH(2+3)L-天冬酰胺溶于水中,并定容至100ml。
    3.19 吐溫80溶液:將25g吐溫-80溶于乙醇并定容至250ml。
    3.20 維生素B12標(biāo)準(zhǔn)溶液(均使用棕色試劑瓶)
    (1)3.20.1維生素B12標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(100ng/ ml):稱取50μg(精度0.01mg天平)維生素B12暗紅色針狀結(jié)晶,用(1+4)的乙醇溶液定容至500ml,儲(chǔ)存在2~4℃條件下。
    (2)3.20.2維生素B12標(biāo)準(zhǔn)中間液(1ng/ml):取1ml儲(chǔ)備液用(1+4)的乙醇定容 至100ml.貯存于2~4℃條件下。
    (3)3.20.3 維生素B12標(biāo)準(zhǔn)使用液(0.02ng/ ml):取1ml中間液用水定容至50ml,用時(shí)現(xiàn)配。
    ? 維生素B12見光易分解,因此在配制標(biāo)準(zhǔn)液時(shí)要盡量避光,并且一定要使用棕色試劑瓶。
    3.21 基本培養(yǎng)基:將下列試劑混合于500ml燒杯中,加水至200ml,以溴甲酚紫作外指 示劑,用10mol/L氫氧化鈉液調(diào)節(jié)pH為6.0~6.1,用水稀釋至250ml。
    酸解酪蛋白25ml
    腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶溶液5ml
    天冬胺酰溶液5ml
    吐溫-80溶液5ml
    甲鹽溶液5ml
    乙鹽溶液5ml
    維生素溶液Ⅰ5ml
    維生素溶液Ⅱ5ml
    黃嘌呤溶液5ml
    抗壞血酸1.0g
    L-胱氨酸0.1g
    D,L-色氨酸0.1g
    無水葡萄糖10.0g
    無水乙酸鈉8.3g
    該培養(yǎng)基也可從Difco公司購得,產(chǎn)品號(hào)為No.0457-15-1。
    ? 由于國內(nèi)某些試劑純度不夠,所以自行配制的培養(yǎng)基較渾濁,嚴(yán)重影響到最后的濁度測(cè)定結(jié)果,因此建議最好使用進(jìn)口培養(yǎng)基。
    3.22 瓊脂培養(yǎng)基:在600ml水中,加入15g蛋白胨,5g水溶性酵母提取物干粉,10g無水葡萄糖,2g無水磷酸二氫鉀,100ml番茄汁,10ml吐溫-80溶液,每500ml液體培養(yǎng)基加5.0~7.5g瓊脂,加熱溶解,用10mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為6.5~6.8,然后定容至1000ml,分裝于試管中,于121℃高壓滅菌10分鐘,取出后豎直試管,待冷卻至室溫后于冰箱保存。
    3.23 生理鹽水:稱取9.0g氯化鈉溶于1000ml水中,。每次使用時(shí)分別倒入2~4支試管中,每支約加10ml,塞好棉塞,于121℃高壓滅菌10分鐘,備用。
    3.24 0.4g/L溴甲酚紫指示劑:稱取0.1g溴甲酚紫于小研缽內(nèi),加1.6ml 0.1mol/L氫氧化鈉研磨,加少許水繼續(xù)研磨,直至完全溶解,用水稀釋至250ml。
    4.儀器與設(shè)備
    4.1 實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備
    4.2 電熱恒溫培養(yǎng)箱
    4.3 壓力蒸汽消毒器
    4.4 液體快速混合器
    4.5 離心機(jī)
    4.6 硬質(zhì)玻璃試管:20mm×150mm
    5.菌種與培養(yǎng)液的制備與保存
    5.1 儲(chǔ)備菌種的制備:Lactobacillusleichmannii(ATCC7830)接種于直面瓊脂培養(yǎng)管中,在37±0.5℃恒溫箱中培養(yǎng)16~24小時(shí),取出后放入冰箱中保存。每周至少傳種二次以上。在實(shí)驗(yàn)前一天必須傳種一次。
    ?Lactobacillusleichmannii (ATCC7830)的生命力不強(qiáng),每周一定要至少傳代2-3次,否則極易死亡!
    5.2 種子培養(yǎng)液的制備:加2ml 0.02ng/ml維生素B12標(biāo)準(zhǔn)工作液和3ml基本培養(yǎng)基于10ml離心管中,塞好棉塞,于121℃高壓滅菌10分鐘,取出冷卻后于冰箱中保存。每次制備兩管,備用。
    ? 加入離心管中的維生素B12標(biāo)準(zhǔn)工作液要適量,過少會(huì)阻礙Lactobacillus Leichmanni的生長,過多會(huì)使零管中的光密度值增大,影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。一般2-3ml即可。
    6. 操作步驟
    6.1 接種液的配制:使用前一天,將已在瓊脂管中生長16~24小時(shí)的L.leichmannii 接種于種子培養(yǎng)液中,在37±0.5℃培養(yǎng)16~24小時(shí),取出后離心10分鐘(3000rpm),棄去上清液,用已滅菌的生理鹽水淋洗2次,再加入3ml滅菌生理鹽水,混勻后,將此液倒入已滅菌的注射器中,立即使用。
    6.2 水解液的制備:稱取1.3g無水磷酸二氫鈉、1.2g檸檬酸及0.1g焦亞硫酸鈉(Na2S2O5),溶于水中并定容至100ml,用時(shí)現(xiàn)配。
    6.3 稱取適量樣品,至于100ml三角瓶中,加70ml水解液,混勻,于121℃高壓滅菌10分鐘,取出冷卻至室溫,過濾,然后以溴甲酚紫為外指示劑,用10mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為6.0~6.1,將水解液移至100ml容量瓶中,定容至刻度。為保證最后樣品測(cè)定管中的Na2S2O5的濃度≤0.03mg/ml,因此要做適當(dāng)?shù)南♂尅?br /> ? 測(cè)定管中Na2S2O5的濃度一定要小于0.03mg/ml,過多會(huì)抑制L.Leichmannii的生長,因此在稱取樣品時(shí)要考慮到后來的稀釋倍數(shù),避免由于稀釋倍數(shù)過大造成測(cè)定管中的維生素B12含量過低,無法檢出。
    ? 實(shí)驗(yàn)所用的所有試管必須在烤箱中180-200℃條件下干熱滅菌2-3小時(shí)。
    6.4 樣品試管的制備:每組平行樣品管中分別加入1.0、2.0、3.0、4.0ml樣品水解液,并用水稀釋至5ml,然后再加入5ml基本液體培養(yǎng)基。
    6.5 標(biāo)準(zhǔn)系列管的制備:每組試管中分別加入維生素B12標(biāo)準(zhǔn)工作液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml,使每組試管中維生素B12的含量為0.00ng、0.02ng、0.04ng、0.06ng、0.08ng、0.1ng,加水至5ml,再加入5ml基本液體培養(yǎng)基,需做三組標(biāo)準(zhǔn)曲線。
    6.6 滅菌:樣品管與標(biāo)準(zhǔn)管均用棉塞塞好,于121℃高壓滅菌10分鐘。
    ? 滅菌時(shí)間不宜過長,否則會(huì)破壞基本培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分,影響Lactobacillus Leichmannii的生長,最好在5-10分鐘內(nèi)。
    6.7 接種與培養(yǎng):待試管冷至室溫后,每管接一滴種子菌液,于37±0.5℃恒溫箱中培養(yǎng)16~20小時(shí)。
    ? (1)接種前,接種室要在紫外燈下消毒至少30分鐘。(2)在接種時(shí),其中一支標(biāo)準(zhǔn)系列0管可不接種,這樣可觀察此次實(shí)驗(yàn)是否存在污染,并且可消除由于管中液體的顏色造成的誤差。
    6.8 測(cè)定光密度值:于640nm波長條件下,以標(biāo)準(zhǔn)系列中零管調(diào)節(jié)儀器零點(diǎn),測(cè)定樣品管液體及標(biāo)準(zhǔn)管液體的光密度值。
    ? 首先以未接種的標(biāo)準(zhǔn)系列0管進(jìn)行儀器調(diào)零,然后在用接種后的標(biāo)準(zhǔn)系列0管進(jìn)行二次調(diào)零,之后再測(cè)定其他管中液體的光密度值。
    7.結(jié)果計(jì)算
    以維生素B12標(biāo)準(zhǔn)系列的不同納克數(shù)為橫坐標(biāo),光密度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由樣品測(cè)定管中的光密度值在曲線上查出相對(duì)應(yīng)的樣品測(cè)定管中的維生素B12含量,再按以下公式計(jì)算樣品中維生素B12含量:
         c·V·f
    X= --------------×100
          m×1000
    式中:
    X──樣品中維生素B12含量,μg/100g:
    c──測(cè)定管中的維生素B12含量,ng:
    V──樣品水解液的定容體積,ml:
    f──樣品液的稀釋倍數(shù)
    m──樣品質(zhì)量,g。
    100/1000 ── 單位換算系數(shù)
    8.注意事項(xiàng)
    (1) 全部實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)注意避免日光直接照射。
    (2) 在人體腸道中,大腸桿菌可以合成維生素B12,因此,此實(shí)驗(yàn)極易被污染,在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中,最重要的是注意清潔問題,確保所用的玻璃器皿、操作環(huán)境要清潔。


     
     

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