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  • 淀粉的國標測定方法

    發布于 2011/09/16閱讀(1679)來源 zxj標簽 淀粉檢測

    摘要

    測定食物中淀粉的方法有酶水解法、酸水解法、可消化淀粉和抗性淀粉的測定方法(酶-直接法)

    內容

    淀粉的國標測定方法
    測定食物中淀粉的方法有酶水解法、酸水解法、可消化淀粉和抗性淀粉的測定方法(酶-直接法)
    一、酶水解法
    1.原理
    樣品經除去脂肪及可溶性糖類后,其中淀粉用淀粉酶水解成雙糖,再用鹽酸將雙糖水解成單糖,最后按還原糖測定,并折算成淀粉。
    2.適用范圍
    GB5009.9-85,適用于所有含淀粉的食物。
    3.儀器
    (1) 回流冷凝器
    (2) 水浴鍋
    4.試劑
    除特殊說明外,實驗用水為蒸餾水,試劑為分析純。
    (1) 乙醚
    (2) 0.5 % 淀粉酶溶液:稱取淀粉酶(Sigma公司, E.C3.2.1.1)0.5 g,加100ml水溶解,加入數滴甲苯或三氯甲烷,防止長霉,貯于冰箱中。(注:配成溶液的淀粉酶破壞很快,最好鄰用現配。)
    (3) 碘溶液:稱取3.6 g碘化鉀溶于20 ml水中,加入1.3 g碘,溶解后加水稀釋至100 ml。
    (4) 85 %乙醇。
    (5) 其余試劑同《蔗糖測定方法》
    5.操作方法
    5.1 樣品處理
    稱取2~5 g樣品,置于放有折疊濾紙的漏斗內,先用50 ml乙醚分5次洗除脂肪(注:如果脂肪含量少,此步驟可免),再用約100 ml85 %乙醇洗去可溶性糖類(注:此步驟目的是去除可溶性糖),將殘留物移入250 ml燒杯內,并用50ml水洗濾紙及漏斗,洗液并入燒杯內,將燒杯置沸水浴上加熱15 min,使淀粉糊化,放冷至60 ℃以下,加20ml淀粉酶溶液,再55~60 ℃保溫1h,并時時攪拌(注:溫度過高,淀粉酶的活性破壞)。然后取1滴此液加1滴碘溶液,應不現蘭色,若顯蘭色,再加熱糊化并加20ml淀粉酶溶液,繼續保溫,直至加碘不顯蘭色為止。加熱至沸,冷后移入250ml容量瓶中,并加水至刻度,混勻,過濾。(注:此時淀粉已水解成雙糖,過濾可去除殘渣和纖維素)棄去初濾液,取50 ml濾液,置于250ml錐形瓶中,加5 ml 6 mol/L鹽酸,裝上回流冷凝器,在沸水浴中回流1h,冷后加2滴甲基紅指示劑,用5mol/L氫氧化鈉溶液中和至中性,溶液轉入100 ml容量瓶中,洗滌錐形瓶,洗液并入100ml容量瓶中,加水至刻度,混勻備用。(淀粉在沸水浴條件下糊化是淀粉水解的第一步反應,然后在淀粉酶的作用下,分解成短鏈淀粉、糊精、麥芽糖等低聚合的糖,所以在淀粉酶解后需用酸進一步水解得到葡萄糖。)
    5.2 測定
    按《還原糖的測定方法》操作。同時量取50 ml水及與樣品處理時相同量的淀粉酶溶液,按同一方法做試劑空白試驗。
    6.計算
      X1=
               (A1-A2)×0.9              
     ×100  ……………(1)
     
    m1×
      V1
     ×
      V3
     ×1000
     
    V2
     100
     


    式中: X1--樣品中淀粉的含量,%;
    A1--測定用樣品中還原糖的含量。Mg;
    A2--試劑空白中還原糖的含量,mg;
    0.9--還原糖(以葡萄糖計)換算成淀粉的換算系數;
    m1--稱取樣品質量,g;
    V1--水解用樣品溶液體積,ml;
    V2--樣品定容總體積,ml;
    V3--測定用樣品處理液的體積,ml。
    二、酸水解法
    1.原理
    樣品經除去脂肪及可溶性糖類后,其中淀粉用酸水解成具有還原性的單糖,然后按還原糖測定,折算成淀粉。
    2.適用范圍
    本法適用于含淀粉的食物
    3.儀器
    (1) 水浴鍋。
    (2) 高速組織搗碎機:1200 rpm。
    (3) 皂化裝置并附250 ml錐形瓶。
    4.試劑
    除特殊說明外,實驗用水為蒸餾水,試劑為分析純。
    (1) 乙醚。
    (2) 85%乙醇溶液。
    (3) 6mol/L鹽酸溶液。
    (4) 10mol/L氫氧化鈉溶液。
    (5) 2.5mol/L氫氧化鈉溶液。
    (6) 甲基紅指示液:0.2 %乙醇溶液。
    (7) 精密pH試紙。
    (8) 20 % 乙酸鉛溶液,
    (9) 10 % 硫酸鈉溶液。
    (10) 其余試劑同還原糖的測定。
    5.操作方法
    5.1樣品處理
    5.1.1糧食、豆類、糕點、餅干等較干燥的樣品:稱取2.0~5.0 g磨碎過40目篩的樣品,置于放有慢速濾紙的漏斗中,用30ml乙醚分三次洗去樣品中脂肪,棄去乙醚。再用150 ml 85 %乙醇溶液分數次洗滌殘渣,除去可溶性糖類物質。并濾干乙醇溶液,以100ml水洗滌漏斗中殘渣并轉移至250ml錐形瓶中,加入30 ml 6 mol/L鹽酸,接好冷凝管,置沸水浴中回流2h。回流完畢后,立即置流水中冷卻。待樣品水解冷卻后,加入2滴甲基紅指示劑,先以40 %氫氧化鈉溶液調至黃色,再以6mol/L鹽酸校正至水解液剛變紅色為宜。若水解液顏色較深,可用精密pH試紙測試,使樣品水解液的pH約為7。然后加20 ml 20%乙酸鉛溶液,搖勻,放置10 min。再加20 ml 10 %硫酸鈉溶液,以除去過量的鉛。搖勻后將全部溶液及殘渣轉入500ml容量瓶中,用水洗滌錐形瓶,洗液合并于容量瓶中,加水稀釋至刻度。過濾,棄去初濾液20 ml,濾液供測定用。
    5.1.2蔬菜、水果、各種糧豆含水熟食制品:按1:1加水在組織搗碎機種搗成勻漿(蔬菜、水果需先洗凈、涼干,取可食部分)。稱取5~10g勻漿(液體樣品可直接量取),于250 ml錐形瓶中,加30 ml乙醚振搖提取(除去樣品中脂肪),用濾液過濾去除乙醚,再用30ml乙醚淋洗兩次,棄去乙醚。以下按5.1.1自"再用150 ml 85%乙醇溶液"起依法操作。
    5.2 測定
    按還原糖的測定步驟操作。
    6.計算X2 =
               (A3-A4)×0.9              
     × 100 ……………( 1 )
     
    m2×
      50
     ×
      V2  ×1000
     
    250
     100
     


    式中: X2--樣品中淀粉的含量,%;
    A3--測定用樣品中還原糖的含量。mg;
    A4--試劑空白中還原糖的含量,mg;
    m2--稱取樣品質量,g;
    V2--測定用樣品處理液的體積,ml。
    500--樣品液總體積,ml;
    0.9--還原糖(以葡萄糖計)換算成淀粉的換算系數;
    (注:酸水解能分解部分半纖維素,形成具有還原力的單糖,如木糖、阿拉伯糖等,可影響分析結果。為了比較正確地測定食物中淀粉含量,建議采用淀粉酶糖化淀粉,除去不可溶性的殘渣后,再用酸水解使之成為葡萄糖,然后測定其含量,最后換算成淀粉。


    三、可消化淀粉和抗性淀粉的測定方法(酶-直接法)
    1.原理
    樣品先在37℃下經α-淀粉酶水解,使可消化淀粉轉化成葡萄糖,用80%乙醇提取,未水解的抗性淀粉部分經沸水浴凝膠化后,在淀粉葡萄糖苷酶轉化成葡萄糖,用葡萄糖氧化酶法分別測定葡萄糖含量,再換算成可消化淀粉和抗性淀粉含量。
    2.適用范圍
    參考Englyst和Champ的方法。適用于所有含淀粉食物的測定。
    3.儀器
    (1) 恒溫水浴箱
    (2) 溫箱
    (3) 分光光度計
    4.試劑
    除特殊說明外,實驗用水為蒸餾水,試劑為分析純。
    (1) 0.1mol/L乙酸緩沖液 (pH 5.0):稱取14.28 g 乙酸鈉 (CH3COONa·3H2O)溶于水中,加入2.7ml 冰乙酸,并調節pH 5.0, 用水定容至1 L。
    (2) 酶溶液:分別稱取4gα-淀粉酶溶液(α-amylase,Sigma公司)、1g淀粉葡萄糖苷酶溶液(amyloglucosidase,Sigma 公司)和0.3g轉換酶(invertase,Sigma公司)溶液于研缽中,用 0.1mol/L乙酸緩沖液研磨制成勻漿,并調節體積為100ml。3000rpm離心5min,取上清液。
    (3) 淀粉葡萄糖苷酶溶液: 稱取2 g 淀粉葡萄糖苷酶(amyloglucosidase, Sigma 公司),加100 ml0.1 mol/L 乙酸緩沖液研磨成勻漿。3000 rpm離心5 min,取上清液。
    (4) 80%乙醇:800ml 乙醇加水至1L。
    (5) 4mol/L氫氧化鉀溶液:稱取224g氫氧化鉀,用水溶解并加至1L。
    (6) 2 mol/L乙酸溶液:量取冰乙酸118ml,加水至1L,混勻。
    (7) 其它試劑同《葡萄糖測定方法》。
    5.操作步驟
    5.1樣品處理:測定RS1時,直接稱取樣品0.2g~1g;測定RS2時,選用生的樣品,先研磨打碎后再稱取樣品0.2g~1g,。測定RS3時,則先將樣品加水煮沸至少15min,使之凝膠化,然后取出放入4℃冰箱冷藏過夜,再混勻后稱取樣品0.2g~1g (需折合水分)。加入10 ml酶溶液,輕輕混勻。37℃ 溫箱或水浴中酶解16 h。加入40 ml 無水乙醇,使乙醇含量終濃度為80%,充分搖勻。靜置30min,3000 rpm 離心15min,上清液轉移至100ml 容量瓶中。用80%乙醇反復洗滌沉淀2 ~3次。合并上清液并用乙酸緩沖液定容,供測定可消化淀粉用。
    5.2水解抗性淀粉:將經反復洗滌的沉淀置于100℃干燥,然后用15ml水將沉淀轉移至錐形瓶中,沸水浴中加熱30min。冷卻至室溫。加入1倍體積的4 mol/L 氫氧化鉀溶液,使氫氧化鉀終濃度為2mol/L,室溫下混合30min。(注:在樣品凝膠化后,2mol/L氫氧化鉀的作用是進一步破壞淀粉結構,如果氫氧化鉀的濃度過高或過低,不利于結構破壞,操作中需注意。)加入約30ml2 mol/L 乙酸溶液,調節pH為5.0,再加入淀粉葡萄糖苷酶溶液5 ml,65℃~70℃水浴90min。冷卻后將水解液轉移至100ml容量瓶中,用乙酸緩沖液定容至刻度。過濾。
    5.3測定:吸取0.5ml上清液(5.1)和抗性淀粉水解液(5.2),按照葡萄糖氧化酶法分別測定葡萄糖含量(從測定步驟開始)。同時做葡萄糖標準曲線。
    6.計算
    根據葡萄糖標準曲線得出上清液中和抗性淀粉水解液中葡萄糖濃度,再根據稀釋定容體積和稱樣量分別計算出可消化淀粉和抗性淀粉含量。X=
     (As-Ab)×V×F
     × 0.1 × 0.9
     
    0.5× m
     


    式中: X--樣品中可消化淀粉/抗性淀粉含量,g/100g;
    As-- 由標準回歸方程求出的樣品測定管中葡萄糖含量,mg;
    Ab--由標準回歸方程求出的樣品空白管中葡萄糖含量,mg;
    V--樣品定容體積,ml;
    F--稀釋倍數
    0.5--測定時吸取樣品提取液的體積,ml;
    m--樣品質量,g;
    0.1--將mg/g轉換成g/100g的系數。
    7.注意事項
    7.1 Eglyst根據抗性淀粉的分類,對樣品處理采用不同的處理方法。讀者可根據實驗需要選擇相應的方法。
    7.2Eglyst測定抗性淀粉時,模擬胃腸道內環境,根據α-淀粉酶水解時間長短,將20min時已水解的淀粉稱為快消化淀粉,20min~120min水解的淀粉稱為慢消化淀粉,120min后仍沒有水解的淀粉稱為抗性淀粉。有的學者指出在體內實驗中,腸道對淀粉的消化能力可能超過6h,認為120min的水解時間過于短暫,并建議水解時間應延長至16h。目前國際上檢測方法尚沒有完全統一,多采用的是Eglyst和Champ的方法,這里的方法是對二者的綜合并略加改進。
    7.3如果將樣品先用80%乙醇去除可溶性糖后,再加水煮沸,使之凝膠化,然后用氫氧化鉀破壞淀粉結構,進而采用淀粉葡萄糖苷酶水解,所測定的結果即為總葡萄糖(total glucose)含量。結果乘以0.9即為總淀粉含量。


     

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