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  • 維生素A的測定方法

    發(fā)布于 2011/10/08閱讀(1937)來源 zxj標(biāo)簽 維生素A

    摘要

    維生素A的測定方法

    內(nèi)容

    維生素A的測定方法
    比色法

    1.原理
      維生素A在三氯甲烷中與三氯化銻相互作用,產(chǎn)生藍色物質(zhì),其深淺與溶液中所含維生素A的含量成正比。該藍色物質(zhì)雖不穩(wěn)定,但在一定時間內(nèi)可用分光光度計于620nm波長處測定其吸光度。

    2.儀器
      實驗室常用設(shè)備 分光光度計 回流冷凝裝置

    3.試劑
      本實驗所用試劑皆為分析純,所用水皆為蒸餾水
    1) 無水硫酸鈉 Na2SO4
      (2) 乙酸酐
      (3) 乙醚 不含有過氧化物
      (4) 無水乙醇 不含有醛類物質(zhì)
      (5) 三氯甲烷 應(yīng)不含分解物,否則會破壞維生素A
      檢查方法:三氯甲烷不穩(wěn)定,放置后易受空氣中氧的作用生成氯化氫和光氣。檢查時可取少量三氯甲烷置試管中加水振搖,使氯化氫溶到水層。加入幾滴硝酸銀溶液,如有白色沉淀即說明三氯甲烷中有分解產(chǎn)物。
      (6) 25%三氯化銻-三氯甲烷溶液 用三氯甲烷配制25%三氯化銻溶液,儲于棕色瓶中(注意避免吸收水分)
      (7) 50%氫氧化鉀溶液(KOH) W/V
      (8) 維生素A標(biāo)準(zhǔn)液 視黃醇(純度85%Sigma)用脫醛乙醇溶解維生素A標(biāo)準(zhǔn)品,使其濃度大約為1ml相當(dāng)于1mg視黃醇。臨用前用紫外分光光度法標(biāo)定其準(zhǔn)確濃度。
      (9) 酚酞指示劑 用95%乙醇配制1%溶液

    4. 操作步驟
      維生素A極易被光破壞,實驗操作應(yīng)在微弱光線下進行。

    4.1樣品處理:根據(jù)樣品性質(zhì),可采用皂化法或研磨法。

    (1)皂化法:
      皂化:根據(jù)樣品中維生素A含量的不同,稱取0.5g~5g樣品于三角瓶中,加入20~40ml無水乙醇及10ml1:1氫氧化鉀,于電熱板上回流30min至皂化完全為止。(皂化法適用于維生素A含量不高的樣品,可減少脂溶性物質(zhì)的干擾,但全部實驗過程費時,且易導(dǎo)致維生素A損失)
    提取:將皂化瓶內(nèi)混合物移至分液漏斗中,以30ml水洗皂化瓶,洗液并入分液漏斗。如有渣子,可用脫脂棉漏斗濾入分液漏斗內(nèi)。用50ml乙醚分二次洗皂化瓶,洗液并入分液漏斗中。振搖并注意放氣,靜置分層后,水層放入第二個分液漏斗內(nèi)。皂化瓶再用約30ml乙醚分二次沖洗,洗液傾入第二個分液漏斗中。振搖后,靜置分層,水層放入三角瓶中,醚層與第一個分液漏斗合并。重復(fù)至水液中無維生素A為止。
    洗滌:用約30ml水加入第一個分液漏斗中,輕輕振搖,靜置片刻后,放去水層。加15 ~20ml0.5mol/L氫氧化鉀液于分液漏斗中,輕輕振搖后,棄去下層堿液,除去醚溶性酸皂。繼續(xù)用水洗滌,每次用水約30ml,直至洗滌液與酚酞指示劑呈無色為止(大約洗滌3次)。醚層液靜置10~20min,小心放出析出的水。
      濃縮:將醚層液經(jīng)過無水硫酸鈉濾入三角瓶中,再用約25ml乙醚沖洗分液漏斗和硫酸鈉兩次,洗液并入三角瓶內(nèi)。置水浴上蒸餾,回收乙醚。待瓶中剩約5ml乙醚時取下,用減壓抽氣法至干,立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中維生素A含量在適宜濃度范圍內(nèi)。

    (2)研磨法:
      研磨:精確稱2~5g樣品,放入盛有3~5倍樣品重量的無水硫酸鈉研缽中,研磨至樣品中水分完全被吸收,并均質(zhì)化。(研磨法適用于每克樣品維生素A含量大于5~10μg樣品的測定,如肝樣品的分析。步驟簡單,省時,結(jié)果準(zhǔn)確)
      提取:小心地將全部均質(zhì)化樣品移入帶蓋的三角瓶內(nèi),準(zhǔn)確加入50~100ml乙醚。緊壓蓋子,用力振搖2min,使樣品中維生素A溶于乙醚中。使其自行澄清(大約需1~2h),或離心澄清(因乙醚易揮發(fā),氣溫高時應(yīng)在冷水浴中操作。裝乙醚的試劑瓶也應(yīng)事先置于冷水浴中)。
      濃縮:取澄清提取乙醚液2~5ml,放入比色管中,在70~80℃水浴上抽氣蒸干。立即加入1ml三氯甲烷溶解殘渣。

    4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:準(zhǔn)確取一定量的維生素A標(biāo)準(zhǔn)液于4~5個容量瓶中,以三氯甲烷配制標(biāo)準(zhǔn)系列。再取相同數(shù)量比色管順次取1ml三氯甲烷和標(biāo)準(zhǔn)系列使用液1ml,各管加入乙酸酐1滴,制成標(biāo)準(zhǔn)比色列。于620nm波長處,以三氯甲烷調(diào)節(jié)吸光度至零點,將其標(biāo)準(zhǔn)比色列按順序移入光路前,迅速加入9ml三氯化銻-三氯甲烷溶液。于6秒內(nèi)測定吸光度,將吸光度為縱坐標(biāo),以維生素A含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

    4.3樣品測定:于一比色管中加入10ml三氯甲烷,加入一滴乙酸酐為空白液。另一比色管中加入1ml三氯甲烷,其余比色管中分別加入1ml樣品溶液及1滴乙酸酐。其余步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。

    6.計算
    X = C/m×V×100/1000;

    式中
    X: 樣品中含維生素A的量,mg/100g(如按國際單位,每1國際
    單位= 0.3μg維生素A);
    C: 由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品中含維生素A的含量,μg/ml;
    m: 樣品質(zhì)量,g;
    V: 提取后加三氯甲烷定量之體積,ml;
    100: 以每百克樣品計。
     

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