1 范圍

本標準規(guī)定了乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內酰胺酶類藥物的檢驗方法。

本標準適用于乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內酰胺酶類物質的檢驗。

本方法的檢出限為4U/mL。

2 原理

該方法采用對青霉素類藥物絕對敏感的標準菌株，利用舒巴坦特異性抑制β-內酰胺酶的活性，并加入青霉素作為對照，通過比對加入β-內酰胺酶抑制劑與未加入抑制劑的樣品所產生的抑制圈的大小來間接測定樣品是否含有β-內酰胺酶類藥物。

3 設備和材料

除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下：

3.1 抑菌圈測量儀或測量尺。

3.2恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。

3.3 高壓滅菌器。

3.4 無菌培養(yǎng)皿:內徑90 mm，底部平整光滑的玻璃皿，具陶瓦蓋。

3.5 無菌牛津杯：外徑(8.0士0.1) mm，內徑(6.0士0.1) mm，高度(10.0士0.1) mm。

3.6 麥氏比濁儀或標準比濁管。

3.7 pH計。

3.8 無菌吸管：1mL（0.01mL刻度值），10mL（0.1mL刻度值）。

3.9 加樣器:5μL～20μL，20μL -200μL及配套吸頭。

4 培養(yǎng)基和試劑　

除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，水為GB/T6682中規(guī)定的三級水。

4.1 試驗菌種：藤黃微球菌(Micrococcus luteus) CMCC(B) 28001，傳代次數(shù)不得超過14次。

4.2 磷酸鹽緩沖溶液：按附錄A中A.1規(guī)定。

4.3生理鹽水（8.5 g/L）：按附錄A中A.2規(guī)定。

4.4 青霉素標準溶液：按附錄A中A.3規(guī)定。

4.5 β-內酰胺酶標準溶液：按附錄A中A.4規(guī)定。

4.6 舒巴坦標準溶液按附錄A中A.5規(guī)定。。

4.7 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：按附錄A中A.6規(guī)定。

4.8 抗生素檢測用培養(yǎng)基Ⅱ：按附錄A中A.7規(guī)定。

5.操作步驟

5.1 菌懸液的制備

    將藤黃微球菌接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，經36士1℃培養(yǎng)18h-24 h，用生理鹽水洗下菌苔即為菌懸液，測定菌懸液濃度，終濃度應大于1×1010 CFU/mL，4 ℃保存，貯存期限2周。

5.2 樣品的制備

將待檢樣品充分混勻，取1 mL待檢樣品于1.5 mL離心管中共4管，分別標為：A、B、C、D，每個樣品做三個平行，共12 管，同時每次檢驗應取純水1 mL加入到1.5 mL離心管中作為對照。如樣品為乳粉，則將乳粉按1:10的比例稀釋。如樣品為酸性乳制品，應調節(jié)pH值至6-7。

5.3 檢驗用平板的制備

取90mm滅菌玻璃培養(yǎng)皿，底層加10 mL滅菌的抗生素檢測用培養(yǎng)基Ⅱ,凝固后上層加入5 mL含有濃度為1×108 CFU/mL藤黃微球菌的抗生素檢測用培養(yǎng)基Ⅱ,凝固后備用。

5.4  樣品的測定

按照下列順序分別將青霉素標準溶液、β-內酰胺酶標準溶液、舒巴坦標準溶液加入到樣品及純水中：

A 青霉素5 μL。

B 舒巴坦25 μL、青霉素5 μL。

C β-內酰胺酶25 μL、青霉素G5 μL。

D β-內酰胺酶25 μL、舒巴坦25 μL、青霉素5 μL。

混勻后，將上述A～D 試樣各200 μL 加入放置于檢驗用平板上的4個無菌牛津杯中，36士1℃培養(yǎng)培養(yǎng)18～22 h ，測量抑菌圈直徑。每個樣品，取三次平行試驗平均值。

5.5 結果報告

純水樣品結果應為：（A）、（B）、（D）均應產生抑菌圈；（A）的抑菌圈與（B）的抑菌圈相比，差異在3 mm以內(含3 mm)，且重復性良好；（C）的抑菌圈小于（D）的抑菌圈，差異在3 mm以上(含3 mm)，且重復性良好。如為此結果，則系統(tǒng)成立，可對樣品結果進行如下判定。

7.1 如果樣品結果中（B）和、（D）均產生抑菌圈，且（C）與（D）抑菌圈差異在3 mm以上（含3 mm）時，可按7.1.1、7.1.2 判定結果。

7.1.1（A）的抑菌圈小于（B）的抑菌圈差異在3 mm以上(含3 mm),且重復性良好，應判定該試樣添加有β- 內酰胺酶，報告β- 內酰胺酶類藥物檢驗結果陽性。

7.1.2（A）的抑菌圈同（B）的抑菌圈差異小于3 mm，且重復性良好，應判定該試樣未添加有β- 內酰胺酶，報告β- 內酰胺酶類藥物檢驗結果陰性。

7.2 如果（A）和（B）均不產生抑菌圈，應將樣品稀釋后再進行檢測。

附 錄 A

（規(guī)范性附錄）

培 養(yǎng) 基

A.1 磷酸鹽緩沖溶液（pH6.0）   

     無水磷酸二氫鉀  8.0 g

     無水磷酸氫二鉀  2.0 g

     蒸餾水          加至1000 mL

A.2 生理鹽水（8.5 g/L）

     氯化鈉          8.5 g

     蒸餾水          1000 mL

     121℃高壓滅菌15 min。

A.3 青霉素標準溶液

    準確稱取適量青霉素標準物質，用磷酸鹽緩沖溶液溶解并定容為0.1  mg/mL的標準溶液。當天配制，當天使用。

A.4 β-內酰胺酶標準溶液

    準確量取或稱取適量β-內酰胺酶標準物質，用磷酸鹽緩沖溶液溶解并定容為16000 U/mL的標準溶液。當天配制，當天使用。

A.5 舒巴坦標準溶液

    準確稱取適量舒巴坦標準物質，用磷酸鹽緩沖溶液溶解并定容為1 mg/mL的標準溶液，分裝后-20 ℃保存?zhèn)溆茫豢煞磸蛢鋈谑褂谩?/span>

A.6 營養(yǎng)瓊脂

    蛋白胨       10 g

    牛肉膏       3 g

    氯化鈉       5 g

    瓊脂         15-20 g

    蒸餾水       1000 mL

將上述成分加入蒸餾水中，攪混均勻，分裝試管每管約5~8 mL，120℃高壓滅菌15 min，滅菌后擺放斜面。

A.7 抗生素檢測培養(yǎng)基Ⅱ

    蛋白胨      10 g

    牛肉浸膏    3 g

    氯化鈉      5 g

    酵母膏      3 g

    葡萄糖      1 g

    瓊脂        14 g

    蒸餾水      1000mL

將上述成分加入蒸餾水中，攪混均勻，120 ℃高壓滅菌15 min，其最終pH 值約為6.6。