1、分子量的測定
根據凝膠色譜的原理，樣品物質在凝膠色譜柱中的洗脫性質與該物質的分子大小有關。因此選用不同的凝膠色譜柱后，能方便地測定物質的分子量。用此法測定分子量時，可以在各種PH值、離子強度和溫度條件下進行。所測定的物質可以是天然狀態，也可以是變性后的。
實際應用中，可先選用一系列已知分子量的標準樣品在同一色譜條件下進行色譜分離分析，并以保留體積（或保留時間）對分子量的對數作圖，在一定分子量范圍內得到一直線（標準曲線），而后根據待測定物在同一條件下的保留體積（或保留時間），從標準曲線上查得/計算出其分子量。

目前用本法測定分子量的應用范圍非常廣泛。
高分子物質的分子量及其分布的測定：特別是近年來，隨著各種高分子材料的問世，人們對高分子科學的不斷探索，高聚物的分子量及其分布的測定顯得尤為重要，成為科研和生產中不可缺少的測試項目之一。例如：常見的聚苯乙烯塑料制品，其分子量為十幾萬，如果聚苯乙烯的分子量低至幾千，就不能成型；相反，當分子量大到幾百萬，甚至幾千萬，它又難以加工，失去了實用意義。科研和生產上通過控制高聚物的分子量及其分布寬度指數D（D=Mw/Mn）、分子量微分分布曲線、分子量積分分布曲線來生產出性能最佳的高聚物產品。同樣，除了快速測定分子量及其分布以外，凝膠滲透色譜還廣泛被用于研究高聚物的支化度，共聚物的組成分布及高聚物中微量添加劑的分析等方面。如果配以在線的絕對分子量檢測器（如：LALLS、Multi-Angle LS、Dual-Angle LS等），凝膠滲透色譜可以測定高聚物的絕對分子量。
蛋白質分子量的測定：現代蛋白質藥物的研究中，凝膠色譜法測定分子量是蛋白質分子量的快速測定方法之一。一般選用標準分子量蛋白質（如：鐵蛋白、醛縮酶、牛血清白蛋白、卵清蛋白、胃蛋白酶、核糖核酸酶，這就是一組分子量從300KD到14KD的標準品）。

2、分離多組分混合物
在一個多組分混合物中，因各組分的分子量的不同，可以用凝膠色譜法將其各組分分開。當被分離組分的分子量相距較大時，如進行蛋白質和氨基酸，核酸和核苷酸等分離時，選擇大顆粒、高交聯度的凝膠。而當分離物質的分子量差別較小，則選擇一種膠粒能使被分離的組分均包括在該膠粒的分布范圍內。
3、脫鹽與分離純化
特別是在生物大分子的分離純化過程中，經常使用鹽進行鹽析或洗脫，其高濃度的鹽會給下一步的純化帶來不便，因此需將其全部或大部分除去。透析法除鹽不僅耗時較長，而且較煩瑣。凝膠色譜脫鹽就是一種簡單又快速的方法。由于脫鹽是將分子量相距很大的兩類物質的分開，所以一般用于脫鹽的凝膠多為大顆粒、高交聯度的凝膠。此時，溶液中大分子（如蛋白質）的kd=0，鹽類的kd=1，易于分離脫鹽。實際中常用G-25進行脫鹽，其效果不僅比透析法快的多，而且比較完全，并且回收率高。
4、去熱源
熱源是微生物產生的某些可以使人發熱的物質，多為內毒素，是制藥中必須去除的物質。內毒素是一個含脂肪A、糖類和蛋白，是帶負電的復合大分子。內毒素經常是多聚體，凝膠過濾層析可有效地將之去除，特別是在小分子藥物。選用的凝膠可以與脫鹽類似，只是此時熱源等大分子物質的kd=0，而小分子藥物的kd=1，同樣可以很好而且很方便地去除熱源類物質。